呼吸系統疾病動物模型(二)

   隨著大氣污染、吸煙、工業經濟發展導致的理化因子增多以及人口年齡老化等因素,呼吸系統疾病近年來有明顯增長的趨勢。

由于呼吸疾病涉及的器官較多,包括氣管、支氣管及肺部等,單以肺部為例,所涉疾病就包括肺阻塞、肺纖維化、肺氣腫、哮喘等,下面,武漢云克隆將以大鼠/小鼠為模式動物,介紹幾種常見的肺部疾病動物模型。

 

 4.特發性肺纖維化

特發性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)為不明原因引起的成人慢性、進展性、纖維化性間質性肺炎。

    4.1 建模方法:

SPF級C57/BL6雌性小鼠,體重約18~20g。使用氣管滴注博來霉素法建模。

麻醉小鼠,仰臥固定于實驗臺上,頸部去毛后酒精消毒,切開皮膚,逐層暴露氣管,將1mL注射器經兩氣管軟骨環間隙朝向心端刺入氣管,回抽無阻力,則注入博萊霉素 5mg/kg/L(對照組注入等量的生理鹽水)。手術完畢后迅速將動物直立、旋轉,使藥液在肺內分布均勻,動物清醒后常規飼養。 

    4.2 模型鑒定及后續檢測:

肺纖維化模型發展時間:給藥后第 7 天肺組織大多呈重度肺泡炎改變,肺泡腔及肺間質內有大量中性粒細胞浸潤,部分肺泡腔破壞或消失,肺間隔內成纖維細胞和毛細血管增生,與正常肺組織對比差別明顯;給藥后第14天,肺纖維化開始形成。巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞明顯減少,成纖維細胞增多,肺泡間隔明顯增厚,有膠原沉積。給藥后第28天,多數小鼠發生彌漫性肺間質纖維化,肺間質被膠原纖維和成纖維細胞替代,肺泡壁破壞,肺大泡形成,但仍可見炎性細胞浸潤。

      

圖5. 特發性肺纖維化模型小鼠(右)相對于對照組小鼠肺部組織MASSON染色對比(4周)

 

5.急性肺損傷模型

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,造成彌漫性肺間質及肺泡水腫,導致的急性低氧性呼吸功能不全。以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調為病理生理特征,臨床上表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫,肺部影像學上表現為非均一性的滲出性病變,其發展至嚴重階段(氧合指數<200)被稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。

    5.1 急性肺損傷大鼠模型建立

SPF級SD雄性大鼠,體重約200~220g。使用脂多糖(LPS)誘導建立急性肺損傷模型。

將大鼠放入固定盒中,用酒精檫拭大鼠尾靜脈后,按壓住尾靜脈1/3處,注射器進針后回抽有血后注入LPS溶液(溶于生理鹽水,給藥劑量10mg/kg),從而建立內毒素性急性肺損傷大鼠模型。對照組的大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。

    5.2 模型鑒定及后續檢測:

    5.2.1 肺損傷后的目視觀察:

如下圖所示,在急性肺損傷模型小鼠中,肺部有多處明顯滲血,后有肉眼可見肺部大面積出血滲出,可以直觀的反映肺損傷程度。

圖6. 急性肺損傷模型大鼠(右)與對照組大鼠肺部照片對比

 

    5.2.2 肺的濕/干重比檢測:

肺的濕/干重比是反應肺水腫的直接指標,也是反應肺損傷嚴重程度的敏感指標。在急性肺損傷發生后,大量液體滲出至肺泡和肺間質,導致肺的重量增大,而肺的干重則不受影響。處死大鼠、剪斷氣管后取全肺,稱濕重,然后將肺置于65℃恒溫箱中干燥,24h 后取出稱干重,計算肺濕/干重比值。

圖7. 急性肺損傷模型大鼠(ALI)與對照組大鼠肺干濕重比隨不同時間點的變化。 

    5.2.3 肺泡盥洗液(BALF)中細胞計數:

小鼠取血后,開胸,分離縱膈,注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中,每次反復灌洗3次后抽出灌洗液,肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min,取上清,保存于-80度用于后續檢測。用 PBS沖洗沉淀物,然后用Diff-Quik染色液染色,在光學顯微鏡下進行細胞分類,觀察計數計數中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。

    5.2.4 肺損傷后的組織病理觀察 :

取左肺4%多聚甲醛固定,然后將肺組織常規脫水,石蠟包埋,切片(厚度為5μm),HE染色。HE染色肺組織學評價可以直觀的反應肺損傷的程度,ALI組織病理學主要表現為肺泡中性粒細胞及紅細胞的滲出,肺泡壁透明膜的形成。HE染色后可在低倍鏡下觀察到整個左肺組織的炎癥細胞浸潤、水腫以及損傷,評估肺部損傷分布情況;而高倍鏡下則可以對肺泡結構進行辨認,對肺損傷程度進行評估和評分。

    評分方法:取6個視野進行出血及水腫評分。

0分:沒有損傷

1分:<25%的損傷面積

2分:25%~50%的損傷面積

3分:50%~75%的損傷面積

4分:>75%的損傷面積

 

圖8. 急性肺損傷模型大鼠(右圖)與對照組大鼠(左圖)肺組織HE染色

 6.哮喘模型

哮喘又名支氣管哮喘。支氣管哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥,此種炎癥常伴隨引起氣道反應性增高,導致反復發作的喘息、氣促、胸悶和/或咳嗽等癥狀,多在夜間和/或凌晨發生,此類癥狀常伴有廣泛而多變的氣流阻塞,可以自行或通過治療而逆轉。

    6.1 哮喘小鼠模型建立

SPF級Balb/c雌性小鼠,體重約20g。采用OVA致敏誘導建立哮喘模型。

OVA致敏誘導的哮喘模型:分別于第1、8、15 天腹腔注射OVA 混懸液(含OVA 1 g /L,氫氧化鋁5 g /L) 0.2 ml,實驗第21 天起將小鼠置于霧化激發器內,給予2% OVA 生理鹽水霧化激發,1次/d,每次30 min,連續7 天,將小鼠呼吸急促,搔鼻抓癢、嗆咳煩躁、點頭運動等作為哮喘小鼠模型成功的標準。正常對照組以生理鹽水代替OVA腹腔注射和霧化激發,操作同上所述。

    6.2 模型鑒定及后續檢測:

    6.2.1 小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF) TH2型細胞因子蛋白水平檢測

待造模完成后,抽取BALF后用ELISA方法檢測其中TSLP、IL-33和MUC5AC的表達情況。

附支氣管肺泡灌洗液抽取方法:小鼠取血后,開胸,分離縱膈,注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中,每次反復灌洗3次后抽出灌洗液,肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min,取上清。

結果顯示:哮喘模型小鼠與對照組小鼠相比,炎性因子及趨化因子水平均有顯著性升高。

 

圖9. 哮喘模型小鼠與對照小鼠BALF中各類細胞因子的表達水平對比

 

    6.2.2 肺組織病理學檢測

HE染色檢測:待造模完成后,腹腔麻醉小鼠后,開胸暴露胸腔:取左側肺葉固定于 10%甲醛溶液 24h,常規脫水石蠟包埋,切片行 HE 染色,光鏡下觀察。

結果顯示:空白對照組小鼠肺泡結構清晰,肺泡大小均勻,氣道黏膜上皮結構完整,纖毛排列整齊;模型對照組小鼠肺組織肺間隔增厚,支氣管部分上皮細胞脫落,有淋巴細胞浸潤。

 

圖10. 哮喘模型小鼠(右)相對于對照組小鼠肺部組織HE染色對比

阿爾辛藍—過碘酸雪夫氏染色(AB-PAS染色)檢測:待造模完成后,腹腔麻醉小鼠后,開胸暴露胸腔:取左側肺葉固定于 10%甲醛溶液 24h,常規脫水石蠟包埋脫蠟至水,切片行 AB-PAS染色,光鏡下觀察。

結果顯示:與對照組相比,模型組小鼠的肺組織支氣管上皮杯狀細胞增多。

 

圖11. 哮喘模型小鼠(右圖)相對于對照組小鼠(左圖)肺部組織PAS染色對比

 


安卓能不能下载qq麻将 _百家乐玩法 江西11选5开奖分布走势图 福建36选7app 3d试机号关注码是 理财平台排行哪个比较靠前 金7乐走势图怎么看 内蒙古11选5分布图 湖北体彩11选5前三组遗漏 股票分析师王健怎么样 北京十一选五遗漏数